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Rosetta 2(DE3)

文字:[大][中][小] 2018-5-8    浏览?#38382;?b class="red">1210    

Rosetta 2(DE3) Chemically Competent Cell 产品说明书




产品规格 (CAT#: EC1014)

Rosetta 2(DE3):                                               100μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                           10μl

保存条件(保质期):                                   -80℃(6个月) 


基因型


F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) pRARE2 (CamR)


产品说明

Rosetta 2(DE3)菌株来源于BL21,是BL21的衍生菌株,为Lon蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株,这两种酶的缺失有效防止异源蛋白在大肠?#21496;?#20307;内的降解。将具有氯霉素抗性的pRARE2质粒导入BL21 (DE3)细胞中即是Rosetta 2(DE3),pRARE2质粒可补充大肠?#21496;?#32570;乏的7种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA和CGG)对应的tRNA,提高外源基因的表达水平。该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区 (DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶),可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠?#21496;鶵NA聚合酶,可用于pET系列,pGEX,pMAL等质粒的蛋白表达。Rosetta 2(DE3)感受态细胞?#21830;?#27530;工艺制作,pUC19质粒检测转化效率达108 cfu/μg DNA。


操作方法

1. Rosetta 2(DE3)感受态细胞从-80℃拿出,?#26438;?#25554;入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的质粒并用?#26893;?#25171;EP管底轻轻混匀(避免?#20204;?#21560;打),冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒,?#26438;?#25918;回冰中并静置2分钟,晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的LB无菌培养?#28023;?7℃,200 rpm复苏60分钟。

4. 5000 rpm离心一分钟?#31449;?#30041;取50 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。



Sample Induction Protocol (for reference only )

1. Inoculate a single colony from a freshly streaked plate into 3ml of LB medium containing the appropriate antibiotic for the plasmid and host strain.

2. Incubate with shaking at 200 rpm at 37℃ overnight. 

3. Inoculate 50 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic with 0.5 ml of the overnight culture prepared in step 2(use the 500 ml triangular flask as the container would be better).

4. Incubate with shaking at 150 rpm at 37℃ until the OD 600 reaches 0.5-0.8. (0.6 recommended; about 2.5h).

5. (Optional)Pipet 1ml of  the cultures into clean microcentrifuge tubes and  place the tubes on ice until  needed  for gel analysis or storage at  -20℃. These will serve as the non-induced control samples.     

6. Add IPTG to a final concentration of 1 mM. Optimal time for induction of the target protein may vary from 2-16 hours, depending on the protein.

7. Incubate with shaking at 120 rpm at 37℃ for 2-4 hours. To determine the optimal time for induction of the target protein, it is recommended that a time course experiment be performed varying the induction from 2-16 hours.

8. Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 minutes at 4℃.

9. Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃ (storage at lower temperatures is also acceptable).  


IPTG配制:

     Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 

     by dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use. 


氯霉素配制

Chloramphenicol  34 mg/ml in ethanol. Store at -20℃. Use at 34 μg/ml.


注意事项

1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化,插入冰中8分钟内加入目标DNA,不可在冰中放置时间过长,长时间存放会降低转化效率。

2. 转化高浓度的质粒?#19978;?#24212;减少最终用于涂板的菌量。

3. 诱导?#20445;琁PTG浓度可选(0.1-10 mM均可)。

4. 为获得需要量的蛋白,最佳诱导时间,温度,IPTG浓度需实验者优化。

5. Rosetta 2(DE3) 菌株携带 pRARE2质粒,除复苏培养基为无抗生素外,其余所用培养基、培养液均应含有34 μg/ml氯霉素,以防质粒丢失。





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